蘇州千舍生物提示細(xì)胞培養(yǎng)需注意事項(xiàng)

細(xì)胞培養(yǎng)在生命科研的地位舉足輕重。實(shí)驗(yàn)君的很多成果可謂是成也細(xì)胞培養(yǎng)，敗也細(xì)胞培養(yǎng)。然而細(xì)胞虐我千百遍，我待細(xì)胞如初戀！科研人是不會這么被輕易打敗的。

1.新買的細(xì)胞如何處理？

細(xì)胞剛拿到手應(yīng)趕緊做這幾件事：檢測瓶子是否破裂；培養(yǎng)基是否漏出，是否渾濁；是否有支原體污染；迅速擴(kuò)增凍存。

2.能否使用與原先培養(yǎng)條件不同的培養(yǎng)基？

不能。每一細(xì)胞株均有其特定使用且已適應(yīng)的細(xì)胞培養(yǎng)基，若驟然使用和原先提供培養(yǎng)條件不同的培養(yǎng)基，細(xì)胞大都無法立即適應(yīng)，造成細(xì)胞無法存活。

3.購買的細(xì)胞死亡或存活率不佳可能原因？

常見原因可能有：培養(yǎng)基使用錯(cuò)誤或培養(yǎng)基品質(zhì)不佳；血清使用錯(cuò)誤或血清的品質(zhì)不佳；解凍過程錯(cuò)誤；冷凍細(xì)胞解凍后，加以洗滌細(xì)胞和離心；懸浮細(xì)胞誤認(rèn)為死細(xì)胞；培養(yǎng)溫度使用錯(cuò)誤；培養(yǎng)箱氣體濃度達(dá)不到要求；細(xì)胞置于 –80 ℃ 太久。

4.收到的冷凍管瓶身破裂，瓶蓋有裂紋，或瓶蓋脫落的原因？

冷凍管瓶蓋裂紋，或瓶身破裂，可能是因?yàn)椴僮髡邐A取冷凍管時(shí)用力不當(dāng)，造成冷凍管裂損，建議使用止血鉗小心夾取。另冷凍管瓶蓋松動或松脫，是因熱脹冷縮的物理現(xiàn)象，冷凍管有可能因此而造成細(xì)胞污染，故冷凍管于放入和取出液氮桶時(shí)，均應(yīng)立刻將冷凍管再一次扭緊。

5.冷凍管應(yīng)如何解凍？

將冷凍管由液氮桶中取出解凍時(shí)，必須注意安全，可佩戴防護(hù)眼鏡和手套預(yù)防冷凍管的爆裂。取出冷凍管后，須立即放入 37 ℃ 水浴環(huán)境中快速解凍，輕搖冷凍管使其在 1 分鐘內(nèi)全部融化，避免由于緩慢融化使水分滲入細(xì)胞內(nèi)形成胞內(nèi)再結(jié)晶對細(xì)胞造成損害。并注意水面不可超過冷凍管蓋沿，否則易發(fā)生污染情形。

6.細(xì)胞冷凍管解凍培養(yǎng)時(shí)，是否應(yīng)馬上去除 DMSO？

現(xiàn)在大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室會在解凍細(xì)胞后加培養(yǎng)液將DMSO除去，但也有研究者認(rèn)為除少數(shù)特別注明對 DMSO 敏感的細(xì)胞外，絕大部分細(xì)胞株（包括懸浮性細(xì)胞），在解凍之后，可直接放入含有 10~15 ml 新鮮培養(yǎng)基的培養(yǎng)角瓶中，待隔天再置換新鮮培養(yǎng)基以去除 DMSO 即可，如此可避免大部分解凍后細(xì)胞無法生長或貼附的問題。

7.如何正確選擇培養(yǎng)基種類？

引用幾款比較經(jīng)典的培養(yǎng)基舉例：

Hyclone胎牛血清SH30084.03  、Hyclone胎牛血清SH30406.02  、Hyclone胎牛血清SH30406.05 、Hyclone胎牛血清SH30396.03  、Hyclone胎牛血清SH30070.03

特級胎牛血清 SH30070.03E 、Hyclone胎牛血清 SH30370.03  、活性炭/葡聚糖胎牛血清 SH30068.03  、活性炭/葡聚糖處理胎牛血清，熱滅活 SH30068.03HI 、馬血清SH30074.03  、烏拉圭胎牛血清 SV30087. 03 、Hyclone胎牛血清SH30071.03 、Hyclone胎牛血清SV30160.03。

BOVOGEN胎牛血清 SFBS 、BOVOGEN新生牛血清 SNCS。

PAA 普通胎牛血清FBS A15-101 、PAA 優(yōu)等胎牛血清FBS A15-151。

BI優(yōu)等胎牛血清 04-001-1ACS 、BI ES級別胎牛血清 04-002-1A 、

BI 間充質(zhì)胎牛血清 04-400-1A 。

Corning胎牛血清 35-076-CV。

PAN胎牛血清FBS P30-3302  、PAN胎牛血清FBS ST30-3302 、PAN ES級別胎牛血清 ST30-2602 、PAN胎牛血清Plus ST30-3302P 。

NTC優(yōu)等胎牛血清 SFBE。

Gemini優(yōu)等胎牛血清 900-108 、Gemini特級胎牛血清 100-500  、Gemini科研用人AB血清100-512 。

TCB胎牛血清 101ZC。

Sigma 特級胎牛血清F2442 、Sigma正常人AB血清 H4522 。

SBI 無外泌體血清 EXO-FBS-50A-1

胎牛血清盒裝A31608-02、馬血清16050-122。

雙抗15140-122、SV30010  、胰酶 25200-056、SH30042.01 、GIBCO 胰酶 25200-072。

MCF7/Taxol人乳腺癌紫杉醇耐藥株

HCT8/5-fu 人回腸直腸腺癌細(xì)胞五氟尿嘧啶耐藥株

LOVO/5-FU 人結(jié)腸癌細(xì)胞五氟尿嘧啶耐藥株

HCT116/L人結(jié)腸癌奧沙利鉑耐藥細(xì)胞

HL60/ADR人早幼粒急性白血病細(xì)胞耐阿霉素株

PC9GR(PC9R)人肺癌細(xì)胞耐吉非替尼

LOVO/ADR人結(jié)腸癌細(xì)胞阿霉素耐藥株

HNE1/DDP人鼻咽癌細(xì)胞順鉑耐藥株

SGC7901/5-fu人胃癌細(xì)胞五氟尿嘧啶耐藥株

A549/DDP人肺癌細(xì)胞順鉑耐藥株

MCF-7/DDP人乳腺癌細(xì)胞順鉑耐藥株

A549/ADR人肺癌細(xì)胞阿霉素耐藥株

SGC7901/DDP人胃癌細(xì)胞順鉑耐藥株

SKOV3/DDP人卵巢癌細(xì)胞順鉑耐藥株

HELA/DDP人宮頸癌耐順鉑細(xì)胞株

NCI-H1650 人肺支氣管癌細(xì)胞

RT4 人膀胱移行細(xì)胞乳頭瘤 、SK-N-MC 人神經(jīng)上皮瘤細(xì)胞

SK-N-SH 人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞 、SW982 人滑膜肉瘤細(xì)胞

T98G 人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤 、U251MG(KO) 人類星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞

U266 人骨髓瘤細(xì)胞 、VCAP 人前列腺癌細(xì)胞

hTERT-HPNE 人胰腺導(dǎo)管細(xì)胞 、ES-2 人卵巢透明細(xì)胞癌細(xì)胞

NCI-H1650人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞 、H460 人大細(xì)胞肺癌細(xì)胞

HACAT 人永生化角質(zhì)形成細(xì)胞 、HCT116 人結(jié)腸癌細(xì)胞

HEK293 人胚腎細(xì)胞  、HEPG2 人肝癌細(xì)胞

HGC27 人胃癌細(xì)胞(未分化) 、HT-29 人結(jié)腸癌細(xì)胞

HUVEC 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞 、KYSE150人食道癌細(xì)胞

L02(HL7702)人正常肝細(xì)胞   、LOVO 人結(jié)腸癌細(xì)胞

MCF-10A人正常乳腺上皮細(xì)胞 、MCF7人乳腺癌細(xì)胞

LX-2 人肝星狀細(xì)胞 、MDA-MB-468人乳腺癌細(xì)胞

8.如何選用特殊細(xì)胞系培養(yǎng)基？

培養(yǎng)某一類型細(xì)胞沒有固定的培養(yǎng)條件。在 MEM 中培養(yǎng)的細(xì)胞，很可能在 DMEM 或 M199 中同樣很容易生長?？傊?，shou選 MEM 做粘附細(xì)胞培養(yǎng)，RPMI-1640 做懸浮細(xì)胞培養(yǎng)是一個(gè)好的開始。

9.什么培養(yǎng)基中可以省去加酚紅？

酚紅在培養(yǎng)基中被用來作為 PH 值的指示劑：中性時(shí)為紅色，酸性時(shí)為黃色，堿性時(shí)為紫色。研究表明，酚紅可以模擬固醇類激素的作用（特別是雌激素）。為避免固醇類反應(yīng)，培養(yǎng)細(xì)胞，尤其是哺乳類細(xì)胞時(shí)，用不加酚紅的培養(yǎng)基。由于酚紅干擾檢測，一些研究人員在做流式細(xì)胞檢測時(shí)，不使用加有酚紅的培養(yǎng)基。

10.細(xì)胞培養(yǎng)基的配制和儲存應(yīng)該注意什么？

細(xì)胞培養(yǎng)基配好后，要先抽取少許放入培養(yǎng)瓶內(nèi)在37℃培養(yǎng)箱內(nèi)放置24~48h，已檢測培養(yǎng)液是否有污染，然后方可用于實(shí)驗(yàn)。配置培養(yǎng)基所需的血清要合格并且保持穩(wěn)定。一個(gè)批號試用效果良好后，就可一次購入較多同一批號的血清，這樣實(shí)驗(yàn)條件穩(wěn)定，配液時(shí)調(diào)整pH值較容易。每次配液量以使用兩周左右的量為宜，一次配液不要太多，一是短期內(nèi)用不完造成營養(yǎng)成分損失需要補(bǔ)充，二是量大易造成污染。

11.為何培養(yǎng)基保存于 4 ℃ 冰箱中，顏色會偏紫色？

培養(yǎng)基保存于 4 ℃ 冰箱中，培養(yǎng)基內(nèi)的 CO2 會逐漸溢出，造成培養(yǎng)基越來越偏堿性，而培養(yǎng)基中的酸堿指示劑 （通常為 phenol red） 的顏色也會隨堿性增加而更偏紫色。培養(yǎng)基偏堿的結(jié)果， 將造成細(xì)胞生長停滯或死亡。若培養(yǎng)基偏堿時(shí)，可以通入無菌過濾 CO2，以調(diào)整 pH 值。

12.什么情況下用到無血清培養(yǎng)基？

對于應(yīng)用培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行分離制備細(xì)胞生長因子、單克隆抗體等應(yīng)該選擇無血清培養(yǎng)基。

13.如何選擇正確的血清種類？

14.可否使用與原先培養(yǎng)條件不同的血清種類？

不能。血清是細(xì)胞培養(yǎng)上一個(gè)極為重要的營養(yǎng)來源，所以血清的種類和品質(zhì)對于細(xì)胞的生長會產(chǎn)生極大的影響。來自不同物種的血清，在一些物質(zhì)或分子的量或內(nèi)容物上都有所不同，血清使用錯(cuò)誤常會造成細(xì)胞無法存活。

15.血清滅活是否必須？

這個(gè)問題現(xiàn)在有爭議。有人主張價(jià)格不菲的血清中含有諸如生長因子，維生素，氨基酸等珍貴物質(zhì)，而將它們置于50℃以上的溫度長達(dá)30分鐘的熱處理會對血清中的生長因子，氨基酸等成分帶來的負(fù)面影響。盡管如此，在大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室之中血清的熱滅活還是作為常規(guī)來執(zhí)行，尤其是在昆蟲細(xì)胞和胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)中。

16.培養(yǎng)基中是否添加抗生素？

除特殊篩選系統(tǒng)中外，一般正常培養(yǎng)狀態(tài)下，培養(yǎng)基中不應(yīng)添加任何抗生素。

17.何時(shí)更換培養(yǎng)基？

視細(xì)胞生長密度而定，或遵照細(xì)胞株基本數(shù)據(jù)上的更換時(shí)間，按時(shí)更換培養(yǎng)基即可。

18.細(xì)胞傳代的方法都有哪些？

根據(jù)不同的細(xì)胞采取不同的方法。貼壁生長的細(xì)胞用消化法傳代；部分貼壁生長的細(xì)胞用直接吹打即可傳代；懸浮生長的細(xì)胞可以采用直接吹打或離心分離后傳代，或用自然沉降法吸除上清后，再吹打。

19.原代培養(yǎng)的*傳代應(yīng)注意的問題？

細(xì)胞沒有生長到足以覆蓋瓶底壁的大部分表面以前，不要急于傳代；原代培養(yǎng)時(shí)細(xì)胞多為混雜生長，不同的細(xì)胞有不同的消化時(shí)間，因此要根據(jù)需要注意觀察及時(shí)處理，并根據(jù)不同細(xì)胞對胰蛋白酶的耐受時(shí)間而分離和純化所需要的細(xì)胞；

吹打細(xì)胞時(shí)動作要輕巧盡可能減少對細(xì)胞的損傷；*傳代時(shí)細(xì)胞接種數(shù)量要多一些，使細(xì)胞能盡快適應(yīng)新環(huán)境而利于細(xì)胞生存和增值；隨消化分離而脫落的組織塊也可一并傳入新的培養(yǎng)瓶。

20.使用胰蛋白酶時(shí)加入EDTA的目的？應(yīng)如何處理？

EDTA作用較胰蛋白酶緩和，主要作用在于能從組織生存環(huán)境中吸取Ca2+、Mg2+，這些離子是維持組織完整的重要因素。但EDTA單獨(dú)使用不能使細(xì)胞*分散，因而常與胰蛋白酶按不同比例混合使用，效果較好。常用比例為1：1或者2份EDTA：1份胰蛋白酶。EDTA的工作液濃度為0.02%，用不含Ca2+、Mg2+的BSS配置。如果使用EDTA，在終止消化前，需用緩沖液將消化液清除后才能加培養(yǎng)液。di一次開瓶后應(yīng)立即少量分裝于無菌試管中，保存于 –20 ℃，避免反復(fù)冷凍解凍造成胰蛋白酶的活性降低，并可減少污染的機(jī)會。

21.欲將一般動物細(xì)胞離心下來，其離心速率應(yīng)為多少轉(zhuǎn)速？

欲回收動物細(xì)胞，其離心速率一般為800~1000 rpm，5~10 分鐘，過高的轉(zhuǎn)速，將造成細(xì)胞死亡。

22.細(xì)胞的接種密度為何？

依照細(xì)胞株基本數(shù)據(jù)上的接種密度或稀釋分盤的比例接種即可。細(xì)胞數(shù)太少或稀釋的太多亦是造成細(xì)胞無法生長的重要原因之一。

23.細(xì)胞交叉污染的可能原因？

多種細(xì)胞系進(jìn)行維持傳代操作時(shí)，各細(xì)胞系所需的器材和溶液沒有嚴(yán)格分開，往往會使一種細(xì)胞被另一種細(xì)胞污染。

24.冷凍培養(yǎng)基為什么要加DMSO？

因?yàn)榧?xì)胞在不加任何保護(hù)劑的情況下直接凍存時(shí)，細(xì)胞內(nèi)外的水分都會很快形成冰晶，冰晶的形成將造成細(xì)胞損傷，還可引起細(xì)胞的的死亡。目前多采用甘油和DMSO做保護(hù)劑。這兩種細(xì)胞無明顯毒性，分子量小，溶解度大，易穿透細(xì)胞，可以使冰點(diǎn)下降，提高包膜對水的通透性。

25.DMSO 的等級和無菌過濾的方式為何？

冷凍保存使用的 DMSO 等級，必須為 Tissue culture grade 的 DMSO，其本身即為無菌狀況，di一次開瓶后應(yīng)立即少量分裝于無菌試管中，保存于 4 ℃，避免反復(fù)冷凍解凍造成 DMSO 的裂解而釋出有害物質(zhì)，并可減少污染的機(jī)會。若要過濾 DMSO，則須使用耐 DMSO 的 Nylon 材質(zhì)濾膜。

26.欲冷凍保存時(shí)，細(xì)胞冷凍管內(nèi)應(yīng)有多少細(xì)胞濃度？

冷凍管內(nèi)細(xì)胞數(shù)目一般為 1x106 cells/ml vial，融合瘤細(xì)胞則以 5x106 cells/ml vial 為宜。

27.冷凍保存細(xì)胞的方法？

冷凍保存方法一：冷凍管置于 4 ℃ 30~60 分鐘 →-20 ℃ 30 分鐘 → -80 ℃ 16~18 小時(shí)（或隔夜） → 液氮槽 vapor phase 長期儲存。

冷凍保存方法二： 冷凍管置于已設(shè)定程序的可程序降溫機(jī)中每分鐘降 1~3 ℃ 至 –80 ℃ 以下， 再放入液氮槽 vapor phase 長期儲存。–20 ℃ 不可超過 1 小時(shí)，以防止冰晶過大，造成細(xì)胞大量死亡，亦可跳過此步驟直接放入 –80 ℃ 冰箱中，存活率稍微降低一些。

28.細(xì)胞凍存太多會不會浪費(fèi)？

每一種細(xì)胞系都應(yīng)有充足的凍存儲備，防止由于細(xì)胞污染等因素造成的細(xì)胞系的絕種，而且每一批次培養(yǎng)的細(xì)胞狀態(tài)都不同，應(yīng)該挑選幾個(gè)狀態(tài)較好的批次凍存保種。另外二倍體細(xì)胞等有限細(xì)胞系如果暫時(shí)不用凍存以免傳代太多，造成細(xì)胞衰老或者發(fā)生改變。

29.如何識別和預(yù)防常見的細(xì)胞污染？

細(xì)菌污染：細(xì)菌是一種原核細(xì)胞微生物，其大小以微米(μm)計(jì)。常見的污染細(xì)菌有革蘭氏陰性菌和大腸桿菌、假單胞菌等，革蘭氏陰性菌中白色葡萄球菌等比較常見。

一旦發(fā)生細(xì)菌污染較易發(fā)現(xiàn)，多數(shù)情況下培養(yǎng)液短期內(nèi)顏色變黃，表明有大量酸性物質(zhì)產(chǎn)生，出現(xiàn)明顯混濁現(xiàn)象；有時(shí)靜置的培養(yǎng)液液體初看不混濁，但稍加振蕩，就有很多混濁物漂起。倒置顯微鏡下觀察，可見培養(yǎng)液中有大量圓球狀顆粒漂浮。必要時(shí)可取少量培養(yǎng)液涂片染色檢查以證實(shí)細(xì)菌種類；有的培養(yǎng)液改變不明顯而又疑有污染，可取出少量培養(yǎng)液用普通肉湯接種或用未加雙抗藥物的培養(yǎng)液接種，也可取10ml細(xì)胞懸液以100rpm離心5min，沉淀中加入無抗生素的培養(yǎng)液2ml，置于37℃培養(yǎng)，24h可得結(jié)果。污染后細(xì)胞發(fā)生病理改變，胞內(nèi)顆粒增多、增粗，zui后變圓脫落死亡，造成試驗(yàn)失敗和細(xì)胞株(系)丟失。

看到這種，別猶豫了你的細(xì)胞被污染了，那么怎么辦呢，基本原則立馬扔掉，別擴(kuò)大污染，如果你的細(xì)胞真的十分寶貴，先用帶有雙抗的PBS反復(fù)沖洗幾遍，然后再培養(yǎng)液中加入硫酸慶大霉素、新霉素（50ug/ml）等，培養(yǎng)3天后換成帶有雙抗的培養(yǎng)液培養(yǎng)。

真菌污染：是細(xì)胞培養(yǎng)過程中zui常見的一種，尤其在梅雨季節(jié)進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)更易污染。污染培養(yǎng)細(xì)胞的多為煙曲霉、黑曲霉、毛霉菌、孢子霉、白念珠菌、酵母菌等。霉菌污染后多數(shù)在培養(yǎng)液中形成白色或淺黃色漂浮物。一般肉眼可見，較易被發(fā)現(xiàn)，短期內(nèi)培養(yǎng)液多不混濁，倒置顯微鏡下可見于細(xì)胞之間縱橫交錯(cuò)穿行的絲狀、管狀、及樹枝狀菌絲，并懸浮飄蕩在培養(yǎng)液中。很多菌絲在高倍鏡可見到有鏈狀排列的菌珠；念珠菌或酵母菌形態(tài)呈卵形，散在細(xì)胞周邊和細(xì)胞之間生長。鏡下看時(shí)，要將培養(yǎng)瓶用酒精棉球擦干凈，以防止與瓶外尤其瓶底外面生長的菌絲相混淆。真菌污染后，細(xì)胞生長變慢，但zui后由于營養(yǎng)耗盡及毒性作用而使細(xì)胞脫落死亡。

真菌污染真的不建議處理，因?yàn)殒咦尤菀罪h散，可能這瓶沒9過來，又?jǐn)U大了污染，建議預(yù)防為主，在培養(yǎng)箱的水中加入硫酸銅，就是藍(lán)色的那種東西。哎，如果你非救不可，可以采用兩性霉素B（0.25-2.5），三天后換液加入含PS的培養(yǎng)液。

支原體污染：支原體是一種大小介于細(xì)菌和病毒之間(zui小直徑0．2um)并獨(dú)立生活的微生物。約有1%可通過濾菌器。支原體無細(xì)胞壁形態(tài)呈高度多形性。可為圓形、絲狀或梨形。

支原體形態(tài)多變，在光境下不易看清內(nèi)部結(jié)構(gòu)。電鏡下觀察支原體膜為三層結(jié)構(gòu)。其中央有電干密度大的密集顆粒群或絲狀的中心束。支原體多吸附或散在于細(xì)胞表面和細(xì)胞之間。橫斷面與細(xì)胞微絨毛相似，但微絨毛電子密度比支原體小，且中央無顆粒群或中央束。

支原體污染細(xì)胞后，培養(yǎng)液可不發(fā)生混濁。多數(shù)情況下細(xì)胞病理變化輕微或不顯著，細(xì)微變化也可由于傳代、換液而緩解，因此易被忽視。但個(gè)別嚴(yán)重者，可致細(xì)胞增殖緩慢，甚至從培養(yǎng)器皿脫落。

如果懷疑細(xì)胞被支原體污染可使用支原體檢測試劑盒進(jìn)行檢測，如果確定是支原體污染可以選擇支原體去除試劑進(jìn)行處理。

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